在开展分子克隆、测序前处理工作之际, 众多科研人员常常会碰到一个令人极为困扰的问题, 那就是, 明明试剂并未超过保质期, 操作过程也不存在违规情形, 唯有实验结果却不尽如人意。在此种状况之下, 核酸外切酶活性通常会成为被人们所忽视的潜在杀手。它不像聚合酶那般闪耀夺目, 然而却能够在关键的时刻, 将辛辛苦苦制备完成的单链DNA或者RNA彻底地破坏殆尽。深入领会它的作用机制, 不但属于看懂文献的基本前提, 更是解决实验困境的关键所在。有不少人觉得这仅仅是个生化方面的概念, 事实上, 它于基因编辑之后进行的纯化进程里, 在PCR产物开展去磷酸化的前期处理阶段, 起着具有决定性意义的作用。
为什么我的核酸样品总是降解
参加实验时, 条带弥散现象出现或者浓度突然大幅下降, 首先要去怀疑一下, 是不是引入了外切酶污染这种情况。Taq DNA聚合酶自身缺少3'->5'外切酶校对活性, 然而, 若使用的是高保真酶, 或者又混入了别的酶类, 那么, 非特异性切割就会发生。特别是在低温保存状况下, 或者反复冻融这个过程里, 微量的已被污染的核酸酶会被激活。
还有一个常见缘由是缓冲液所处环境不合适, 某些外切酶对于镁离子浓度极为敏感, 极为微量的变动便能够促使其剪切效率发生改变, 要是你察觉到即便添加了抑制剂, 样品居然依旧不稳定, 那么或许需要再次评估实验用水的质量, 或者容器是不是通过了严格的DEPC处理, 防止非特异性降解乃是维系核酸完整性的首要步骤, 细节决定着成败。
如何利用活性优化实验流程
有的时候, 我们得借助这种活性去“整理”末端。像是在连接反应进行之前,把PCR产物5'端的磷酸基团给去掉核酸外切酶活性, 或者让末端变得平滑, 外切酶便是得力工具。挑选适宜的酶型特别关键, Exo I能够专门切除单链DNA, 而Exo III是作用于双链DNA的3'端的。要是选错了目标 对象, 不但没办法达成目的, 还兴许会把你的模板给破坏掉。
于实际操作里, 控制反应的时间以及温度, 相较于盲目去增加酶量, 会更具成效。短时间、比较低温度进行孵育,通常能够获取到最佳的效果核酸外切酶活性, 既能够去除多余的片段, 同时又不会对目标序列造成损伤。借助精确的调控, 你能够把核酸外切酶从一个潜在的破坏者转变为提升纯度的助手, 使得后续的连接或者测序成功率大幅度地提升。
