身处分子生物学实验幕后, 单链核酸外切酶, 也就是SSEX, 仿若一位精准无比的“清洁工”, 它专门司职清理单链DNA片段, 或者清理单链RNA片段, 尤其是清理那些在完成PCR扩增之后残留的引物, 以及清理那些在完成测序反应后残留的核苷酸。对于科研人员来讲, 理解它具有的机制, 并且掌握它的应用技巧, 是提升实验数据质量的关键一步。众多人错误地认为它能够对双链DNA进行降解, 然而实际情况并非如此, 它呈现出的专一性程度格外高, 仅仅围绕单链的结构来采取行动, 正是这一特殊性质, 致使它在基因克隆, 以及高通量测序前预处理的过程当中, 变为了绝对不能缺少的工具。
单链核酸外切酶到底能降解什么类型的核酸？
这种酶的核心优势在于, 其对于底物具备严格选择性的特点。它主要作用于单链DNA, 也就是ssDNA, 或者单链RNA, 即ssRNA, 从5'端或3'端逐个去水解核苷酸。通常状况下, 我们所使用的是Exo I或Exo VII等变体, 它们对于双链DNA全然没有活性。这意味着, 要是你的PCR产物是双链的, 它不会对目标基因片段造成破坏, 只会把那些多余的、未结合的引物单体给分解掉。
于实际操作当中，这般特异性带来了极大的便利, 举例而言, 在Sanger测序之前, 一定要完全清除过量的ddNTP以及引物, 要不然会对测序峰图的清晰度造成影响, SSEX能够在温和的条件之下迅速降解这些单链杂质, 然而却保留完整的双链模板, 需要留意的是, 它无法降解带有磷酸化修饰或者特殊二级结构的单链核酸, 这就要求实验者在设计引物的时候避开这些干扰因素, 以此确保酶切效率达到最大化。
实验中如何使用单链核酸外切酶提高成功率？
不是简单把酶加入体系就能使用SSEX, 关键在于对反应条件予以优化, 以及对终止步骤加以控制。大多数此类别酶需要特定缓冲环境, 通常含有镁离子或者锌离子作为辅因子。加入酶之后, 要于37摄氏度下孵育15至30分钟, 具体时间由杂质浓度来决定。过量添加酶有可能致使非特异性降解, 而过少则没办法彻底清除残留物, 所以建议先开展小规模预实验来确定最佳用量。
在反应结束之后, 得马上把酶的活性给灭活掉, 为的是避免它在后续的步骤里继续发挥作用。常用办法之中有通过加热来进行灭活处理的举措, 像把温度设定为65摄氏度并持续15分钟这种情况, 还有就是加入EDTA来螯合金属离子。另外, 要是实验所追求的目的是对双链DNA予以纯化, 那么建议在酶解结束以后, 搭配使用酒精沉淀或者柱纯化技术, 将降解之后所产生的小分子核苷酸给完全去除掉。经过如此这般处理的样品, 不管是用于连接转化, 还是用于下一代测序, 均能够明显降低背景噪音, 进而获取到更纯净且更可靠的结果。
