分子生物学里, 核酸外切酶与核酸内切酶是两种极为重要的工具酶, 它们都具备切割DNA或者RNA的能力, 然而切割的方式跟位置全然不一样。简而言之, 核酸内切酶如同一把剪刀, 可从DNA或者RNA链的中间剪断；核酸外切酶却好似一把刨子, 要从链的末端逐一地削掉核苷酸。明晰它们的区别, 对于基因克隆、PCR、测序等实验操作而言相当关键。
核酸外切酶是从哪头切
核酸外切酶切割的方式是从核酸链末端起始, 挨个移除单个核苷酸, 依据作用方向, 它被划分成3'→5'外切酶以及5'→3'外切酶, 例如, 大肠杆菌DNA聚合酶I带有3'→5'外切酶活性, 可在DNA复制之际纠正错配的碱基, 这种校正功能使复制保真度显著提高, 而T4 DNA聚合酶也具备类似活性, 常被用于平末端或者粘性末端的补平反应。
还有一种常见的是λ外切酶, 它会专门朝着3'方向自5'末端动手切割双链DNA, 进而生成3'突出末端, 而这种情况在基因工程里是用于制备单链DNA模板的。核酸外切酶在实验室中常被用来消除DNA末端的突出部位, 或者降解线性DNA, 然而对于环状DNA基本不会产生影响。这是由于环状DNA不存在自由末端, 外切酶难以找到下手之处。
核酸内切酶在链中间怎么切
核酸内切酶的作用方式全然不一样, 它并非由核酸链的末端赖以为凭, 而是去辨识特定的序列或者形状状态, 接着于链的内部将磷酸二酯键截断。最为典范的实例就是限制性内切酶, 像EcoRI, 它去识别GAATTC序列, 并且在G和A这二者相互之间进行切断, 进而衍生出粘性末端。这种酶乃是分子克隆这件事的核心工具, 要是没有它, DNA重组技术便根本无法说起。
包含限制性内切酶之外, 存在非特异性内切酶, 像DNase I, 它不辨认特定序列, 而是随意切割DNA, 通常用于DNase足迹实验或者清除DNA污染。核酸内切酶于DNA修复里也起着关键作用, 例如内切核酸酶能够识别并切除受损的碱基, 为后续修复排除障碍。值得提及的是, 有些酶同时拥有内切和外切活性, 例如T7核酸酶, 既能从内部进行切割, 又能从末端进行切割, 常常用于检测错配或者突变。
两种酶在实验里怎么选
在实际开展操作期间, 挑选哪一种酶是依据你的实验目的来决定的。要是你打算将一个基因片段从质粒之上切下来, 那么必然会选用限制性内切酶, 这是由于它能够精准地识别并且切割特定的位置。要是你想要去除DNA末端的突出部分, 或者是把线性DNA进行降解, 那就会使用核酸外切酶, 例如Exonuclease III, 它能够从3'端逐步消除核苷酸, 常常被用于制备单链DNA模板。
做PCR产物纯化之际, 有时会采用核酸外切酶与碱性磷酸酶的组合方式, 以此来消化掉那些多余的引物以及dNTP。而在DNA测序这个过程中, 核酸外切酶III还能够用来构建嵌套缺失文库, 进而帮助确定基因的边界。两种酶配合运用, 尚且能够实现更为精细的DNA修饰, 比如说先使用内切酶切割出末端, 接着再使用外切酶处理出特定长度的突出。
掌握这两种酶的特性，能让你的分子实验少走很多弯路。
