从事检验工作最怕的就是实验步骤出现差错, 特别是像核酸分子杂交这般精细的操作。好多人认为只要把探针添加进去就可以了, 实际上背后所涉及的原理以及操作方面的具体细节才决定了最终结果的成功与否。我钻研搞分子生物学已经有十几年的时间了, 见到过太多太多因为变性不够彻底或者洗脱过度而引发的假阴性情况。就在今儿把这个过程剖析得清清楚楚、解释得明明白白来讲明白, 好让大家能够尽量减少走不必要的弯路。
核酸杂交前为什么要先变性
常温状态下, 双链DNA具备稳定性, 然而, 探针与靶序列呈单链结构方可实现彼此结合, 通过加热工序或者碱处理方式, 能够致使氢键发生断裂，进而使得双螺旋结构解开转变为单链形态, 此为杂交得以实现的前提条件, 这一步骤绝不可敷衍了事, 温度以及时间均需实施严格把控, 倘若变性程度不达标, 那么探针将无法寻觅到结合位点, 要是变性过度, 极有可能对核酸结构造成破坏, 从而影响后续的结合效率。
变性以后的快速冷却同样重要, 骤然降温能够使单链维持分离状态, 防止它们再度配对构成二级结构, 此时添加过量的标记探针, 探针会优先跟互补的靶序列相结合, 而不是自行卷回来, 这种竞争机制保证了杂交的特异性, 进而让目标信号更为清晰。
杂交后的洗涤为何如此重要
杂交得以完成仅仅只是第一步而已, 并非特异性的结合才是存在的大麻烦所在。探针有可能粘连在膜上任何带有负电的地方, 又或者是与并非靶序列的部分形成微弱的结合情况。要是不将这些呈现“背景噪音”状态的物质洗刷去除掉, 那么到最后进行显色之际将会呈现出一片模糊的态势, 根本就无法清晰地看见条带标点符号。
通常含有去垢剂以及低盐浓度的洗涤液, 其目的是要降低离子强度, 进而削弱非特异性氢键, 盐浓度要是太高, 探针容易出现乱粘的情况, 要是太低, 特异性结合也有可能被破坏, 这是一个相当微妙的平衡需要依据探针长度以及GC含量来进行调整, 掌握洗涤技巧能够大幅度降低假阳性率。
最后一步是进行检测, 要是属于放射性标记, 那就得靠着曝光来显影, 倘若为地高辛或者生物素标记, 那就需要借助酶促反应去产生颜色或者达成化学发光, 整个流程是一环紧扣一环, 任何一个环节出现疏忽, 均有可能致使实验失败, 理解每个步骤所具备的物理化学本质, 相较于死记硬背操作手册而言更具用处, 唯有真正弄清楚为何要这么做, 才能够在遇上意外情况的时候灵活去应对, 而并非盲目地重复无效操作。
