身为进行分子生物学研究工作的科研人员, 我们每日都和各类酶有所接触。说起核酸外切酶, 好多人的第一反应是T7 Exo I或者Lambda Exo核酸外切酶Ⅰ，然而核酸外切酶Ⅰ（Exonuclease I）常常被无视掉。实际上, 在单链DNA具有精准性的去除、引物的降解以及测序文库制备之前的纯化环节中, 它起着无法被取代的作用。明白它拥有的特性, 能够辅助我们在实验设计时躲开诸多难题, 提升数据的准确性。
核酸外切酶I为什么只切单链DNA
Exo I最为关键的特性便是具备高度特异性, 它只会降解单链DNA, 对于双链DNA全然没有活性, 这一特性源自其结构机制, 它没办法结合或者打开双螺旋结构, 这表明, 当我们要从PCR产物或者连接反应里去除多余的引物之时, 要是这些引物是单链的, Exo I便能精确地将其清除掉, 而留存我们的目标双链DNA片段, 这种选择性在制备用于下一代测序的文库之际格外重要, 因为残留的单链引物会干扰测序仪的信号识别, 致使数据质量降低。
在实际去进行操作期间内, 温度以及时间的控制这件事情是极其重要的。一般情况下会建议在37℃的这个温度条件下去进行反应, 该反应历时需要15到30分钟, 紧接着要借助加热的方式使得其灭活。要是反应所持续的时间太过长, 虽说Exo I并不会对双链DNA造成破坏, 不过却有可能会因为非特异性吸附或者是其他一些酶所带来的污染从而致使整体的回收率出现降低的情况。所以说, 精准地计算时间是保障实验能够具备重复性的关键所在。好多新手常常会犯的错误是尝试着使用Exo I去线性化质粒, 这是没有任何效果的, 因为它根本就没办法触碰到双链结构。
核酸外切酶I实验中的常见误区有哪些
又一个常见的误区在于把Exo I跟别的外切酶搞混着去使用, 比如说, 有人试着拿它去消除双链DNA末端的突出端, 这个时候应当选取T7 Exo I或者RecJ f, 而非寻常的Exo I, 除此之外, Exo I的作用方向是朝着从3'端向5'端去进行水解, 这就要求我们于设计实验之际, 务必要明晰目标单链DNA的方向性, 要是引物设计不合适, 又或者模板存有二级结构对酶的结合造成阻碍, 就有可能致使降解不彻底, 残留的引物依旧会对后续步骤产生影响。
酶活受缓冲液选择的直接影响, Exo I需特定盐离子浓度来维持最佳活性, 低盐环境会致使酶失活或活性大幅降低, 需留意避免EDTA等螯合剂存在, 缘于它们会结合镁离子, 而镁离子是Exo I发挥催化作用所需的辅因子, 使用前要检查缓冲液成分表, 以确保无抑制物质混入。
也且不可对储存条件予以忽视核酸外切酶Ⅰ，Exo I当被保存在零下二十摄氏度之处, 要防止出现反复冻融的情况, 一旦解冻了便最好分开装有来保存, 如此方可保障酶活不因时间而衰减掉, 借助对于这些细节方面予以把控, 我们能够充分地利用Exo I所具有的特性, 从而对分子克隆的成功率以及测序实验成功率进行提升！
