做药物研发的朋友, 对此不会陌生核酸适配体（Aptamer）这个词, 做体外诊断的朋友, 对此同样不会陌生核酸适配体（Aptamer）这个词。它被称作“化学抗体”, 在结合特异性上面有独特优势 , 它被称作“化学抗体”, 在稳定性上面有独特优势。不过好多人在实验室阶段受阻, 认为这东西虽说好 ，不过合成难度大, 而且修饰工艺复杂。实际上只要弄清楚了SELEX筛选流程, 同时理清了后期的化学修饰逻辑, 便能够玩转这套技术。今天咱们来谈谈如何让适配体从“能用”转变为“好用”。
为什么我的适配体结合力总不够强
很多刚接触的新手在参与SELEX（指数富集配体系统进化技术）这项工作时, 最为苦恼的便是筛选出来的序列亲合力低下, Kd值难以降低。这种状况通常并非是运气方面的问题, 而是优化策略未能及时跟上。在进行第一轮筛选之后, 势必要借助高通量测序来剖析富集状况, 以此查看哪些序列才是真正呈现阳性的。在这个阶段, 对洗脱条件做出改变是极为关键的, 像是提升盐浓度或者变换温度等方式, 能够将那些属于非特异性结合的“噪音”序列清除掉。
除了对筛选条件进行微调之外, 靶标的固定方式同样会对结果产生直接影响, 倘若靶标蛋白在固相载体上发生了变性, 那么适配体根本无法抓住其天然构象, 所以, 就需要选取较为温和的固定化方法, 像是生物素 - 链霉亲和素体系, 这样便能保留蛋白活性, 另外, 引入随机引物的简并度也是相当重要的, 要是过于简单, 那么库的多样性就会不足, 也就很难碰见那个完美的结合分子。
怎么给适配体加上稳定修饰才不失效
第一步是筛到好序列, 天然的DNA或RNA适配体进入体内后, 很快就会被核酸酶降解, 其半衰期是极短的。要让它能真正得到应用, 就必须进行化学修饰。最常见的做法是, 在5'端加上磷酸基团, 或者在3'端加上磷酸基团, 又或者进行荧光标记, 以此来便于检测。然而更高级的应用, 则需要PEG化修饰, 聚乙二醇链能够屏蔽免疫识别, 能显著延长血液循环时间。
末端修饰之外, 骨架改造同样是重要部分。把核糖2'-位羟基换成氟原子或者甲氧基, 可显著增强抗酶解能力。引入硫代磷酸酯键, 虽说或许会对亲和力有轻度影响, 却换得了极高的稳定性。这些修饰并非随意添加便可, 得依据实验目的精确设计。修饰位点的挑选直接关联适配体的空间构象, 一旦弄错位置核酸适配体合成与修饰核酸适配体合成与修饰，原本完美的结合口袋兴许就塌陷了。
当掌握了筛选方面的精细化、修饰方面的精准化之后, 核酸适配体便不再属于实验室里的冷门技术范畴, 而是成为了能够实现落地的实用型工具。不管是着手开发具备高灵敏度的检测试剂, 又或是致力于构建靶向治疗的药物, 在这其中, 这两步均是至关重要的。
