若要进行分子生物学实验, 核酸凝胶电泳差不多是难以避开的“基本功”。不少人认为它简易, 无非就是让DNA在胶上跑, 以期明晰条带。可在实际操作期间, 从配胶浓度的遴选、上样量的把控, 往后到电泳电压的调控, 每一处细微的差异都会对最终结果的清晰度以及准确性产生影响。对于刚开始接触的新手或者偶有需求做一次检测的研究人员而言, 掌握正确的操作细节以及判断标准, 相较于单纯记下步骤更为重要。
配胶与电泳参数怎么选才合适
凝胶浓度的挑选径直决断了离析成效,要是你打算离析大片段DNA核酸凝胶电泳, 像是超出10kb的片段, 低浓度的琼脂糖凝胶, 像0.6%-0.8%, 孔隙更大, 可使大分子顺畅迁移, 相反, 要是剖析PCR产物或者小片段, 1%-2%的高浓度胶方可给予充足的分辨率, 使相近大小的条带宽窄分明。加入溴化乙锭（EB）或者其他核酸染料的时机相当关键, 在倒胶之前先行加入并使其混合均匀, 又或者是在电泳完毕过后再予以染色, 这两种方式各有各的优点与缺点, 但是务必要严格留意安全防护方面的事宜, 防止跟皮肤产生接触。
即使是电泳缓冲液, 其浓度以及pH值同样不可轻易放置不理。TAE缓冲液适宜用在大片段DNA的分离方面, 然而其导电性并不是很好, 要是长时间进行电泳的话很容易发热；TBE缓冲液具备相当不错的稳定性, 针对于小片段高分辨率的分离较为合适, 不过硼酸有可能对某些酶切反应产生抑制作用。电压设置更是关键中的关键, 要是电压过高的话会致使胶体发热进而产生变形情况, 条带出现拖尾甚至是被断裂；要是电压过低的话则会致使耗费的时间过于冗长且扩散现象十分严重。一般情况下建议每厘米的距离对应5 - 8V的电压, 以此来保持恒温并且条带清晰。
怎么看图？条带异常代表什么
电泳完毕之后,去观察结果才是对于验证实验究竟是成功还是失败极为关键的所在。那理想状态下的条带应当是锐利的、清晰的、不存在拖尾问题的。要是出现条带模糊不清或者呈现为 smear 状的情况核酸凝胶电泳, 一般而言是由于核酸发生了降解, 有可能是样品自身并不稳定, 又或者是在操作过程当中引入了核酸酶污染导致的。倘若条带出现了明显的拖尾现象, 除了电压过高这种情况之外, 还可能是因为上样量过大, 进而致使局部出现过载的状况, 又或者是凝胶孔径并不均匀造成的。
有时你会见到多条并非特异性的条带, 这常常意味着引物二聚体、基因组DNA受到污染或者引物设计存在不佳状况。在琼脂糖凝胶之上, 超螺旋质粒DNA跑得最为快速, 开环的速度居于其次, 线性DNA的速度最为缓慢, 这是由构型所决定的物理特性, 必须要加以区分。经由仔细观察条带的位置、亮度以及形状, 结合分子量标准参照, 才能够准确判断你所拥有的核酸样本质量以及浓度, 为后续的实验提供可靠的依据。
