当开展分子生物学实验, 特别是进行基因克隆、测序或者 NGS 建库工作时, 核酸外切酶与内切酶属于无法避开的俩工具。众多人刚开始接触时这俩容易混淆到一块, 认为两者都是对 DNA 或者RNA进行切割的, 然后想着既然都能做切割, 随意挑出一个就可以了。但事实是完全错误的。一旦酶选得不对, 不但实验会白做, 而且还可能致使珍贵样本以及昂贵的试剂被浪费掉。简要来讲, 内切酶仿若一把精准无误的手术刀, 于核酸链的内部特定之处予以切割；然而外切酶更恰似一名修剪工, 从核酸链的末端一丁点儿一丁点儿地向外啃食。明晰它们的机制差异, 乃是实验成功的首要一步。
内切酶和外切酶作用位点有什么不同
我们常提到的内切酶, 其核心特征体现于“内部切割”, 这是它的关键特性所在, 它会去识别核酸序列里特定的碱基排列, 而这特定的碱基排列就是我们平常所说的限制性位点, 就像常见的EcoRI, 它能够识别GAATTC序列, 然后在G和A之间切断磷酸二酯键, 正是借助这样的特异性, 内切酶才成为了基因工程里构建重组DNA的主力军, 我们可以把它想象成在很长的一条绳子上, 去搜寻到那个特定的结, 然后直接将其剪断, 通过这种切割方式产生的片段一般是双链断裂, 这种双链断裂适合用于把大片段DNA切割成小片段, 也适合用于将目的基因插入载体。
与之相较核酸外切酶与内切酶核酸外切酶与内切酶，外切酶的作用方式全然不同, 它并非识别内部序列, 而是自核酸链的5'端或者3'端起始, 逐个逐个的核苷酸地展开水解, 这表示它不存在任何序列特异性, 只要系从末端开始, 它均会将其去除, 这种特性让外切酶在去磷酸化、去除引物或制备单链DNA方面具备不可替代的作用。好比Shrimp Alkaline Phosphatase（SAP）这般产物, 是一种常常被加以运用的碱性磷酸酶, 尽管在严格的分类范畴之内, 它归属于去磷酸化酶, 然而在功能的逻辑层面之上, 常常会跟外切酶予以配合来运用, 以此防止载体自身连接。而且, 真正的Exonuclease III是从3'端开始逐步地使双链DNA发生降解, 进而产生5'突出端, 这种情况在制作缺失突变体之际是极其有用的。
实验设计中该如何搭配使用这两种酶
处于实际操作的层面 , 内切酶以及外切酶常常并非孤立存在 , 而是要进行协同作战。举例来说 , 于TA克隆或者Blunt克隆之后 , 为了将多余的dNTPs予以去除 , 或者将未消化的引物进行去除 , 我们需借助核酸外切酶I或者Exo III来开展清理。此种情况下要是错误地运用了内切酶 , 极有可能对已然连接好的产物构成破坏 , 致使实验完全失败。所以 , 明确每一个步骤的目的十分关键 , 究竟是为了解切片段 , 还是为了修饰末端 , 又或者是为了降解杂质。
常在二代测序, 也就是NGS文库制备期间, 出现另一种常见场景。内切酶借靠其功能, 把基因组DNA予以打断, 得以变作适宜测序长度的小片段。接着, 或许需用外切酶去处置这些片段的末端, 促使其变为平齐状态或者添加上特定的接头。这般打法组合在一起, 既运用了内切酶具备的高效打断之力, 又发挥了外切酶的精细修饰这一优势。借由合理搭配来启用内切酶与外切酶，能够明显提升文库的质量以及测序数据的准确性。
当开展PCR产物纯化操作期间, 同样要谨慎留意防止外切酶出现污染状况。要是体系之中存有残留的外切酶, 那么它极有可能会对您的PCR产物予以降解, 进而致使电泳图上面呈现出拖尾乃至于没有条带的情形。到了这个时候, 热灭活抑或是柱纯化简直就显得特别关键重要。而针对内切酶而言, 反应过后的灭活相对来讲较为容易, 一般情况下加热就能让其失去活性, 以此不会对后续的连接反应产生影响。
拥有核酸外切酶以及内切酶的特性方面的确切掌握情况, 可不是仅仅单单记住相关定义就可以的, 而更是需要在自己的脑海之中建立一份清晰明确的实验流程示意图表。唯有等到你能够精准无误地预先判断每一种酶在特定条件之下的具体行为表现的时候, 才能够做到从容不迫地应对各种各样纷繁复杂的分子生物学方面的挑战。期望这一篇文章能够帮助你梳理清楚思维链条, 下一次面对那些瓶瓶罐罐之时, 不会再出现犹豫迟疑的情况。
