于分子生物学的研究里头, 众多人常常会问核酸分子杂交可不可以进行定量。好多人的直观感觉觉得, 信号越强烈就代表对应的靶标数量是越多的, 然而, 这仅仅只是一种进行定性或者处于半定量状态的初步判断而已。而真正的定量操作是需要极为严格苛刻的控制与之相关的条件的, 这是由于处在这个里边, 杂交的效率受到序列的复杂度、还有相关的GC含量以及探针设计这些方面实实在在的影响, 情况作用是比较重大较多的。它跟那PCR不一样, 并不具备那种拥有指数级放大这种优势的情况, 所以, 直接把它用于绝对定量的场合是存在天生就有的缺失不足的, 很多时候它是作为一种验证得以体现的手段或者是作为相对丰度的一类参考依据存在着的。
核酸分子杂交能实现绝对定量吗
常规做法的Southern blot或者Northern blot技术, 依靠放射性同位素或者化学发光显影。虽说能够凭借扫描条带密度去估算基因表达量, 可此种属于相对定量的范围领域。不同批次实验当中的曝光时间、底物消耗方面存在的差异, 均都会致使数据出现波动。要是打算把这个方法转变为绝对定量, 那就必须引入已知浓度的标准品去制作标准曲线, 并且要求样品处理过程完全一样。然而, 在实际操作期间样本降解、转移效率不均等这类问题难以消除,这就使得绝对定量的准确性大幅降低了。
核心优势在于高特异性识别的核酸分子杂交核酸分子杂交 能否定量,并非精准计数核酸分子杂交 能否定量, 当探针与目标序列完全匹配时结合紧密, 存在错配则会解离；这种“全或无”的特性适合判断某段序列是否存在, 或者比较样本间同一基因的相对表达水平；比如在检测转基因食品中特定外源基因是否整合进了基因组时, 杂交技术能提供确凿证据, 却无法告诉你确切拷贝数是1个还是10个。
荧光原位杂交FISH定量靠谱吗
存在着另一种常见方式, 它叫做荧光原位杂交（FISH）, 该方式被广泛施行于染色体异常的各类检测以及肿瘤标志物专门性的分析当中。于FISH实验环节里, 借助对阳性细胞比例予以计算或者对荧光斑点数量进行计算, 能够达成一定水准的定量分析。就像在检测HER2基因扩增之际, 医生会去瞧一瞧癌细胞核内部荧光信号的簇集状况。此方法在临床病理诊断领域中有重要价值, 能直观地展现出基因在空间分布层面的改变。
就算FISH给出了可视化的定量数据, 可它的精度还是受到了限制。荧光淬灭会致使结果偏差, 背景噪音干扰会致使结果偏差, 人工计数的主观性也会致使结果偏差。自动化图像分析系统能够提升效率, 不过它还是需要校准。所以, 对于有着极高灵敏度和精度要求的微量核酸定量需求而言, 实时荧光定量PCR, 也就是qPCR, 通常是更佳的选择。杂交技术仿佛是经验很丰富的老专家, 在宏观把握和定性判断方面拿手, 然而在微观精准计量这儿就显得有些费劲了。
