从事分子生物学实验, 特别是关联引物设计的 PCR 反应时, 非常多的人常常会碰到一个让人极度困扰的问题: 非特异性条带数量过多, 或者背景状况不佳。在这个时候, 经验丰富的人通常会提及一种堪称神器的东西——核酸外切酶 I（Exonuclease I）。它并非是那种高端大气上档次的测序仪, 同样也不是价格高昂的试剂盒关键成分, 而是一个价钱低廉、效率颇高并且能够化解大难题的小型工具。简要来讲, 它就是用于清理 PCR 反应体系里残留单链引物的“清洁人员”。要是你察觉到自身的电泳结果老是呈现为糊作一团的状态, 又或者假阳性率始终处于居高不下的情形, 要不暂且停下思考一番, 是不是应当把这位“清洁工”呼唤出来呢。
核酸外切酶exo i如何去除引物二聚体
许多处于初学阶段的人, 在对PCR体系予以配置之时，出于求稳的心态缘故, 会将引物的浓度设置得非常之高。这种操作表面看似较为妥当, 然而实际上却已然埋下了潜在的隐患。数量过多的单链DNA引物, 在退火这个阶段极其容易彼此相结合, 进而形成引物二聚体。这些长度较短的双链片段, 尽管其扩增效率并非很高, 可是在后续开展的实验期间, 却属于一个规模巨大的干扰源头。尤其是在着手进行Sanger测序之前, 要是不将这些残留的引物以及二聚体去除掉, 那么测序峰图将会变得一团混乱, 甚至根本就没办法读取其中的序列。
Exo I 的作用机制极为特异, 它仅能够降解线性的单链 DNA, 对偶联 DNA 一点也没兴趣。这表明着, 它能够精确地吃掉那些多余的单链引物以及由错误配对形成的单链尾巴, 却保护你费劲扩增出来的目标双链 DNA 产物不受到损伤。这种选择性致使它在去除引物方面相较于热灭活或者其他化学方法更具优势。凭借加入适量的 Exo I, 以及在适宜温度下孵育一段时期, 你能够明显降低背景噪音, 使后续的测序或者克隆工作变得轻松不少。重点是把控酶的使用量以及时间, 要是过多的话, 就有可能致使非特异性降解, 要是过少, 那么清理就不会彻底。
核酸外切酶exo i在基因合成中的应用技巧
除了常规的PCR后处理之外, Exo I在基因合成以及定点突变里也起着不可缺少的作用, 由于要多个引物介入进行重叠延伸PCR也就是SOE-PCR或者多片段拼接, 要是这些引物没有被有效清除的话, 它们极有可能会当作模板参与下一轮反应, 进而致使错误的拼接产物或是嵌合体出现, 在这个时候, Exo I就变成了一道必需的过滤网, 用来确保唯有正确配对而后延伸的产物才可以进入下一阶段。
在实际的操作情形当中核酸外切酶exo i，给出的建议却是把存在的那 Exo I 的处理步骤放置到第一轮 PCR 结束之后, 并且是处于第二轮拼接 PCR 开始之前的这个时段。如此这般, 就能够确保第一轮产物所具备的纯度得以圆满保证, 同时还能通过这样的安置去避免残留的引物对第二轮的高效扩增进程产生干扰的情况出现。除此之外, 因为鉴于 Exo I 在处于高温状况下的时候会出现失活的局面, 所以通常而言并不需要借助额外的纯化步骤, 只为了达到去除酶本身的目的, 仅仅是需要简单地通过加热到一定程度使其灭活, 便径直可以开启下一步与初始设定一样的循环反应操作步骤, 非常显著地简化了整个实验所要经历的一般流程。对于那些一心追求高效以及准确性的实验室来讲, 熟练通晓 Exo I 的运用技巧, 常常是促使实验成功率得以提升的至关重要的一步。要牢记, 细节能够决定成败, 处在分子克隆的进程之中核酸外切酶exo i，每一回针对杂质的清除行为, 都是在向着最终的成功铺设道路。
