在分子生物学实验室当中, 核酸外切酶III也就是Exo III, 宛如一把精确的分子手术刀。它跟那些粗暴切割双链DNA的酶不一样, Exo III有着独特的“挑食”习性, 它专门从双链DNA或者RNA-DNA杂交体的3'端起始, 逐个切除核苷酸。对于从事基因克隆、定点突变或者构建缺失突变的科研工作者而言, 理解它的脾气秉性极为关键。许多新手容易将它与普通DNase混淆在一起, 结果致使实验数据一塌糊涂。实际上,只要把控住它的底物特异性核酸外切酶iii, 这般所谓的“刀”便能够供你去使用, 能够精确地切割出你所期望得到的序列片段。
核酸外切酶III的作用机制是什么
Exo III 的核心功能在于其具备 3'-5'外切酶活性, 当将双链 DNA 放入反应体系时, 它能够识别出双链区域, 且会紧紧抓住其中一条链的 3'羟基末端, 一旦这个结合成功了, 它就似吃面条那样, 从 3'端起始, 每次取下一个核苷酸, 此过程是一步步开展的, 直到碰到单链区域或者特定的碱基修饰, 才会停止运作, 特别要留意的是, 它对不同碱基的切除速度可不相同。例如, 它对于嘌呤的亲和力要高于嘧啶, 这一情况表明要是你的DNA序列当中富含嘌呤, 那么酶切的速度或许会更快一点。这种微小的差异在实际操作期间常常被忽略, 然而却有可能致使片段长度不均一的问题产生。另外, Exo III还能够修复某些特定的DNA损伤, 不过这在常规实验里并非是主要运用的要点。理解这种非均匀性的切除过程, 是控制实验精度的第一步。
核酸外切酶III实验操作要注意什么
于实际操作之时, 缓冲液的挑选以及反应时间的把控乃是成败的要点所在。Exo III对Mg2+与Zn2+离子极为敏感, 得使用饱含恰当浓度镁离子的专用缓冲液, 不然酶的活性会大幅降低甚至全然丧失。反应温度的设定亦有门道, 一般是在37摄氏度下开展, 然而为了获取更平滑的切除成效, 有些实验室会选用稍低的温度去减缓酶切速率, 进而达成对片段的精细调控。另外一个容易被忽略的陷阱是酶切产物的纯化。因Exo III会产出单链DNA尾巴, 后续连接效率会受残留酶活性的作用, 所以在反应结束后必须借由加热失活或运用酚氯仿抽提去完全除去酶蛋白。要是你在做删除突变, 提议先做预实验, 经由不同时间点取样电泳,找出那个恰好切到你所期望位置的“黄金时刻”核酸外切酶iii, 而非盲目地长时间孵育。
