开展分子克隆实验, 具备处理PCR产物以及去除单链背景功效的神器是T7核酸外切酶。好多新手朋友在拿到试剂盒之际, 常常面临对着说明书发呆的状况, 不清楚酶切所需的具体时长是多少。也不知道温度该如何把控, 还不懂得怎样配置反应体系才能避免试剂的浪费。这篇文章并不涉及复杂的生化机理内容, 仅仅讲述实际操作过程中容易出现问题的细节之处, 借此帮你透彻并且彻底地清理掉非特异性条带。
T7核酸外切酶反应体系怎么配？
在对反应体系进行配置这个操作的时候, 酶跟DNA二者之间存在的比例是起着关键作用的那一个要点或因素。一般情况下都会给出这样的建议, 也就是针对每微克具备线性双链这种特性的DNA而言, 要使用1单位的T7核酸外切酶。要是你的PCR产物所具有的浓度是比较高的这种情形, 那么一定要先对反应体系予以配置, 防止因为酶的量不足从而致使降解不完全这种状况的发生。buffer的挑选这件事情同样也不可以草率或是疏忽大意, 一定要与Mg2+离子相互配合, 而这是酶能够体现出活性特征所必需不可缺少的辅助因子。
追加酶之后, 缓缓予以混匀, 切不可剧烈震荡, 鉴于T7核酸外切酶对于剪切力颇为敏感, 过度涡旋兴许会致使酶失活或者DNA断裂出现异常。调配好的体系应当即刻放置于冰上, 或者立马放进预热的恒温金属浴内。反应体积通常处于20至50微升的范围之间, 体积过小易于引发边缘效应, 对温度均一性造成影响。
T7核酸外切酶孵育时间与温度如何控制？
标准反应条件是于37摄氏度的环境当中开展进行, 在这样的温度状况之下, 酶的活性处于最高水平, 然而这同时也表明着反应的速度是非常迅速的, 就多数的PCR产物而言, 15至30分钟的孵育时长足以致使单链DNA被降解, 进而保留双链的结构形式, 要是时间持续得过长, 那么酶极有可能会开始对双链DNA的末端实施攻击, 从而使得片段出现缩短的情况, 最终对后续的连接效率产生影响。
要是你察觉到产物当中存在大量引物二聚体, 那么可以酌情将其延长至1小时, 不过得密切进行监控。反应结束之后，建议马上放进65摄氏度水浴10分钟去灭活酶活性。这一步是极为必要的, 不然残留的酶会在后续实验里持续发挥作用, 致使实验结果无法重复。灭活后的样品能够直接用来连接或者转化, 无需进行纯化, 除非你有着特殊的下游应用需求。
