进行RNA-seq或者转录组分析之际, 好多人不停询问5端核酸外切酶究竟该如何使用。此事听起来颇为高端大气上档次, 实则关键就只有一桩事情: 去除尾巴。真核生物的mRNA一般存在一个poly(A)尾, 并且有些降解产物或者非编码RNA或许带有5'延伸部分或者异常结构。5端核酸外切酶（属于Exosome complex的一部分或者特定的Exo I/II）能够专门针对单链或许双链的5'端核苷酸予以切除, 从而助力纯化目标片段, 提升测序数据的精确性。通俗来讲, 它属于分子层面的“修剪师”, 会清理掉多余的、对分析产生干扰的尾部垃圾, 从而使核心序列变得更干净。
5端核酸外切酶具体去除什么杂质
文库构建之前, 样本之中常常杂乱地混合着各类降解产物，像是rRNA残存, 又或是cDNA合成进程里生成的非特异性副产物。倘若这些杂质不加以处理, 便会占据大量的测序通量, 致使有效数据率非常低。而5端核酸外切酶能够识别并且切除携有游离5 '羟基或者磷酸基团的核酸链, 其对于双链DNA有所成效, 对于单链RNA或者含有突出端的DNA片段成效显著, 它能够精确地剥去5'端多余的核苷酸, 直至遭遇空间位阻或者二级结构才会停止。这一机制促使, 唯有那些具备完整特性、呈现正确状态的分子, 才得以留存下来, 进而进入到后续的测序流程之中。
使用5端核酸外切酶的关键注意事项
即便具备强大功能, 然而要是操作出现不当也会致使结果与预期相反。温度以及时间的控制属于最为关键的要点。在大多数情形之下, 37摄氏度进行反应30分钟直至1小时是相对适宜的, 倘若时间过长则有可能引起目标序列也被过度降解掉。缓冲液的pH值和其离子浓度务必要严格契合酶的最适条件, 不然活性会出现大幅下降的状况发生另外, 反应体系之内的镁离子浓度需要精准地加以调整, 因为它是酶的辅因子。要是于实验之中遭遇了效率低下的情形情况, 建议先开展预实验来达成条件的优化。并且, 得留意防范RNase产生污染, 尤其是于RNA样本处理之际, 倘若遭受污染, 全部辛苦都会化为泡影。添加终止液迅速把反应终止同样是重要环节, 防止酶持续发挥作用对后续连接效率造成影响。正确运用它时, 能够显著提高下游数据的水平, 特别是在低起始量样本的建库当中, 优势愈发显著。
