做分子生物学方面的实验, 核酸电泳属于几乎是每个人都必然会碰到的基础操作, 然而不少人瞅见那些模糊得不太清晰的条带, 或者是歪斜着的泳道, 常常是一头雾水, 丈二和尚摸不着头脑。这可不单单只是手法方面的问题, 更是涉及到缓冲液离子强度、电压设置以及凝胶浓度等诸多细节。好多人认为只要依照试剂盒说明书去做就能够得到良好的图谱, 事实上实验条件的细微调整往往是决定成败的关键所在。
为什么我的核酸电泳条带总是拖尾严重
琼脂糖凝胶电泳里, 拖尾现象极为常见, 好多时候是缘自样品存有杂质, 像残留的蛋白质、酚或者盐离子, 这些物质会对核酸在电场之间的迁移造成干扰。要是你提取RNA时没能彻底清除基因组DNA, 又或者质粒提取之后未纯化到位, 电泳图上就会呈现出明显的弥散状拖尾。另外, 上样量过大也是致使条带变形的关键原因, 过多的核酸没办法在凝胶孔径内有序排列, 进而形成云雾状的背景。
还有一个容易被人忽略的因素, 那就是缓冲液的pH值及其离子强度。Tris－醋酸, 也就是TAE, 以及Tris－硼酸, 也就是TBE, 这是两种最为常用的缓冲液, 它们具备有不一样的缓冲能力。TAE的缓冲容量比较低, 要是时间较为长久地进行电泳, 就会致使pH值出现变化, 从而对核酸构象以及迁移率产生影响。要是电泳时间过长, 缓冲液消耗尽了, 条带就会变宽、出现拖尾现象甚至消失。所以呢, 对于大片段DNA而言, 建议使用TBE缓冲液, 因为它有着更高的缓冲能力, 能够给出更为清晰的条带分辨率。
如何判断核酸电泳是否成功并优化结果
先要判定电泳成功与否, 首要得看内参或者Marker是不是清晰, 要是Marker条带锋利、位置精准, 那就表明凝胶聚合度跟电泳条件大体正常, 倘若Marker自身出现畸变, 那就得排查凝胶制备过程了, 像是琼脂糖是不是彻底溶解、冷却温度是不是合适, 好多时候, 凝胶注入模具时产生气泡或者没完全凝固就拔梳子, 都会致使泳道不规则, 直接对后续样品对照的准确性造成影响。
优化结果的关键之处在于电压的挑选, 高电压虽说能够缩短电泳的时间, 然而却会产生数量众多的热量, 致使凝胶出现熔化的情况或者条带发生扩散, 对于常规的1%琼脂糖凝胶来讲, 建议把电压控制在5V/cm左右，要是需要分离小片段核酸的话, 可以适度降低琼脂糖的浓度或者采用聚丙烯酰胺凝胶, 以此来提升分辨率, 记住, 良好的电泳图谱并非偶然获得的, 而是对每一个实验细节进行严格把控所产生的结果, 从配胶一直到成像, 每一步都具有至关重要的意义。
