知晓做实验的人都清楚, 核酸提取乃是分子生物学之中最为基础且最为关键的一个步骤, 如同盖房子得先把地基打好那样, 如果这一步未能妥善完成, 那么后续的PCR或者测序所产生的结果全部都是毫无价值的数据, 许多人认为此项工作简易, 随意购买一个试剂盒便能够将其完成, 然而当真正碰到疑难样本之际, 才发觉里面的窍门十分隐秘复杂难以捉摸得多。
核酸提取有哪些主流方法
现今, 磁珠法已然成为实验室的绝对主流, 它无需等同于酚氯仿那般接触有害有机溶剂, 作业起来安全且迅速, 磁珠表面携有特殊基团, 可于高盐环境里牢牢捕获DNA或RNA, 在洗去杂质后, 通过低盐缓冲液一洗便可将核酸释放逸出, 整体过程自动化程度颇高, 格外契合处理大量样本的需求, 就像医院内的新冠筛查, 一日处理几千个样品亦毫无问题。
硅胶膜离心柱法堪称经典至极, 是经典中的经典。它依据核酸于特定状况下吸附至膜上的原理核酸提取核酸提取，借由多次进行洗涤来除去蛋白以及盐分, 最终经洗脱获取到纯净的核酸。该方法成本低廉, 对设备的要求并非很高, 只要拥有一台普通的离心机便可以。对于那些小批量、只是偶尔开展一次实验的个人研究者而言, 离心柱依旧是性价比最为高的选择。尽管其步骤稍微有些多, 还需要手动进行移液, 然而却好在稳定且可靠是, 出错率相对来说较低。
核酸提取失败常见原因
将样本质量差认定成常常致使提取失败的罪魁祸首, 要是在进行采样期间掺和进过量血液、黏液或者食物残渣, 这些物质会极大抑制后续的酶反应, 特别是RNA提取十分敏感于环境里的RNase, 哪怕只是些许灰尘或者手部未戴手套的接触, 都可能致使RNA降解为碎片, 此时所测出来的OD260/280比值会不正常, 条带模糊难以辨认, 根本无法开展下一步分析。
得率会被洗脱体积以及温度控制不当严重影响, 有些新手为追求高浓度而特意减少洗脱液用量, 致使核酸不能自柱子或磁珠上充分解离, 要记住, 将洗脱温度提升到55至60摄氏度可显著增加核酸溶解度, 另外，洗脱液应提前预热, 且让洗脱液在膜上停留几分钟后再离心, 如此能使结合力更松散, 回收率自然就提高了。
如何提升核酸纯度和浓度
来源各异的样本, 所需采用的乃是不一样的预处理策略, 血液样本一般来讲需进行红细胞的裂解, 而组织样本需借助机械研磨或者酶解去破碎细胞壁, 要是样本里多糖或是多酚含量很高, 就像植物叶片这样, 普通测试盒常常搞不成, 非得添加特殊去除试剂才行, 针对这些复杂样本, 优化裂解时间以及温度是重点, 要做到既要确保细胞完全破裂, 又得躲避核酸被过度剪切。
经纯化后的质检流程不可省略, 需留意电泳条带清晰与否, 还要借助分光光度计测定 A260/A230 以及 A260/A280 的比值, 理想状况下, 这两个比值应分别处于 2.0 - 2.2 与 1.8 - 2.0 之间, 若 A230 数值偏低, 意味着存在盐离子或者有机溶剂残留, 要是 A280 数值偏高, 那么有可能存在蛋白质污染, 鉴于这些数据对后续的实验条件作出调整, 方能一步步摸索出最为契合自身样本的最佳方案。
