在生物实验当中, 酶乃是那柄最为关键的手术刀。当涉及核酸酶时,有不少人脑海里仅仅存有“剪切 DNA”这般模糊的概念核酸酶的种类, 然而实际上, 它们的家族特别庞大, 而且分工非常明确。从最先被发现的限制性内切酶开始, 再到后续 revolutionary 的 CRISPR - Cas9, 接着到用于修饰表观遗传的甲基化酶, 每一种工具都具备其独具特色的适用场景。只有选对工具, 实验才不会白做。理解它们之间的区别, 是分子生物学入门的第一道门槛, 同时也是进阶研究的基石。
什么是限制性内切酶及其作用原理
限制性内切酶, 是分子生物学里极为经典的“剪刀”, 其主要源自细菌, 作用是防御病毒入侵, 它能够识别DNA序列里特定的回文结构, 还会在特定位点实施切割, 这种特异性让科学家得以精准地截取基因片段, 它是构建重组DNA技术的基础, 常见的EcoRI, BamHI等, 都是实验室中的常客。
这类酶被划分成I型、II型以及III型, 当中II型的应用最为广泛, 这是由于它们的识别位点以及切割位点是固定的, 产物是能够预测的。借助不同的切割方式, 还能够产生粘性末端或者平末端, 从而为后续的连接反应给予便利。
操作关键之重要在于掌握识别序列的特异性,不同酶所对应的缓冲液条件常常存在差异核酸酶的种类, 当混合使用这些酶的时候非得对兼容性予以特别留意, 不然极易对酶活产生影响。
CRISPR核酸酶与传统酶的区别
CRISPR - Cas系统象征着基因编辑的新开端, 它与传统限制性内切酶的随意界定不同, 而是经由向导RNA（gRNA）来引领Cas蛋白于精确位置进行锁定。这种具有能够编程的特质, 使得基因编辑如同打字那般简易, 仅仅改变RNA序列便可针对不同基因予以靶向。
Cas9作为最常用的效应蛋白, 其具备造成双链断裂的能力, 凭借此能力进而触发细胞的修复机制, 并由此实现基因敲除或基因插入。与传统酶相比较而言, CRISPR系统在构建方面更具灵活性, 且通量也更高, 所以适合用于大规模筛选。
但是, CRISPR并非毫无瑕疵, 脱靶效应依旧是主要面临的挑战, 让编辑特异性得以提升, 则要对gRNA的设计予以优化且挑选高保真突变体的Cas蛋白, 这在对复杂基因组进行操作当中格外关键。
