1. T7核酸外切酶是这样一种酶, 它专门从双链DNA的5'末端部位开始进行切割。2. T7核酸外切酶逐个释放单核苷酸的酶。3. T7核酸外切酶不会对单链DNA或者RNA进行切割。4. 所以在分子克隆、PCR产物纯化、定点突变筛选等实验当中T7核酸外切酶应用广泛。5. 要是掌握它正确的使用方法, 那么能显著提高实验效率以及结果准确性的。
使用T7核酸外切酶前要准备什么
做实验之前, 得确认一下你找的那个DNA底物, 它状态得是双链型的, 而且还得带着5'突出末端才行。T7核酸外切酶, 对于平末端或者3'突出末端的DNA,它发挥作用的活性是很低的。要是你选的底物不合适t7 核酸外切酶 使用方法, 那酶切效率可就会大幅下降了。所以建议你, 先借助琼脂糖凝胶电泳的方式, 去确认一下DNA片段的末端状态。
配制反应体系之际, 常常会用到10×反应缓冲液, 此缓冲液一般含有50mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、1mM DTT, pH值为7.5, 会按照1/10的体积将其加入。酶的用量, 正常情况下推荐每微克DNA加入1至5单位, 然而具体的用量要依据实验目的进行优化。比如说在用于PCR产物去磷酸化的时候, 用量能够偏低；而在用于快速降解多余引物的时候, 则需要适度增加酶量。
通常将反应温度设定于25℃至37℃的范围之内, 在25℃时T7核酸外切酶的活性甚是温和,适宜那种需要把控反应速率的实验t7 核酸外切酶 使用方法, 在37℃时其活性则更高些, 适宜进行快速处理, 反应时间一般被控制在15分钟至30分钟之间, 倘若时间过长就有可能致使非特异性降解。
如何判断T7核酸外切酶反应是否成功
反应结束之后, 能够借助多种方式开展验证工作。最为直观的办法便是选取少量反应液体去实施琼脂糖凝胶电泳操作, 进而观察DNA条带是不是显著变小或者已然消失不见。要是底物属于线性双链DNA, 在成功实施切割之后条带将会迁移变得更快甚而全然消失掉。
对于PCR产物纯化的那种情形, 能够对产物之中是不是还存有引物二聚体展开检测。T7核酸外切酶能够有效地把5'突出末端的引物给切除掉, 要是电泳图里引物二聚体的条带出现减弱或者消失的状况, 那就表明酶切是有效果的。还有一个可以用来判断的指标是后续连接或者克隆实验的成功概率, 要是连接效率有明显的提高, 那就说明酶切已经将干扰末端给除掉了。
一定要留意, 酶切之后是必须要开展纯化操作的, 其目的在于去除其中所含的酶以及缓冲液成分。常用的方法是, 先进行酚氯仿抽提, 之后再进行乙醇沉淀, 或者也可以采用商业化的DNA纯化柱。残留下来的酶有可能会在后续的反应当中持续切割DNA, 进而对实验结果产生影响。
T7核酸外切酶在使用期间常见的问题涵盖酶切不完全以及出现非特异性条带这两种情况, 前者一般是由于底物末端的状态不对或者酶的量不够, 后者或许是因为反应耗费的时间太久或者体系温度过高, 初次使用时建议设置时间的梯度（5分钟、15分钟、30分钟）以及酶量的梯度（1单位、3单位、5单位）开展预实验, 从而寻得最适配你实验体系的各项条件。
